LA RIVOLUZIONE GENETICA
di Silvano Riva
Direttore dell' Istituto di Genetica e Biochimica ed Evoluzionistica del CNR, Pavia

Tecnologie dell' RNA

E’ sempre più evidente che la regolazione dell'espressione genica si esplica non solo a livello della trascrizione del DNA, ma anche, ed in misura notevole, a livello del metabolismo degli RNA, lungo tutto il percorso che va dalla trascrizione all'esporto degli RNA messaggeri (mRNA) dal nucleo al citoplasma, alla sintesi delle proteine (traduzione) fino alla degradazione degli mRNA.

Metodologie che permettono di manipolare gli RNA in modo mirato e controllato aprono perciò la via ad una serie di interventi "fini" sui delicati meccanismi cellulari con evidenti possibili ricadute di interesse medico e biotecnologico. Queste metodologie sono un'acquisizione piuttosto recente rispetto alle tecniche di clonazione e produzione di proteine ricombinanti che hanno caratterizzato la prima ondata delle applicazioni della biologia molecolare.

Il ritardo nello sviluppo delle tecnologie dell'RNA si spiega da un lato con le difficoltà sperimentali di manipolazione di queste molecole e dall'altro con il fatto che il metabolismo cellulare dell'RNA si è rivelato sorprendentemente complesso e non è ancora completamente chiarito.

I primi tentativi in questa direzione vanno sotto il nome di "strategie antisenso", cioè basate sull'uso di oligonucleotidi sintetici di DNA o di RNA (10-40 nucleotidi) complementari a specifiche regioni di mRNA. Introdotti in vari modi nelle cellule, questi oligonucleotidi si appaiano specificamente all'RNA (con legami Watson-Crick) e ne inibiscono la funzione. Una variante del metodo consiste nel fare sintetizzare dalla cellula una sequenza di RNA complementare (RNA antisenso) a quello dell'RNA normale. La contemporanea presenza di RNA "senso" e "antisenso" porta alla formazione di una doppia catena RNA : RNA che interferisce con il metabolismo e con la stabilità dell'RNA bersaglio.

Le tecniche "antisenso", attualmente in fase di sperimentazione anche clinica, sono state oggetto di un Progetto Strategico del CNR, recentemente conclusosi.

A) Un ribozoma "hammerhead" chimerico legato all'RNA bersaglio. Le barrette sono gli appaiamenti tra basi non conservate. Il "core" catalitico centrale contiene basi altamente conservate. La freccia indica il sito di taglio a valle della sequenza UH ( dove H = A, C o U ). B) "Folding" tridimensionale del complesso ribozima-substrato. E' evidenziato lo ione Mg2+ richiesto per la catalisi.

La recente scoperta che l'RNA può possedere proprietà catalitiche indistinguibili da quelle di un vero e proprio enzima (di qui il neologismo ribozima) ha aperto nuove prospettive di impiego. La reattività del gruppo idrossilico in posizione 2' sul ribosio, unita all'estrema versatilità della catena di RNA nel generare strutture secondarie e terziarie, fa sì che, al suo interno, si possano creare siti dotati di attività catalitiche. Tra queste attività la più interessante dal punto di vista delle applicazioni è la capacità di riconoscere specificamente e di tagliare molecole di RNA bersaglio.

Il ribozima più versatile per scopi applicativi è una molecola di origine naturale, ma ampiamente modificabile, il cosiddetto hammerhead, la cui struttura e modo d'azione sono mostrati nella figura 1. Grazie alla loro attività e specificità di bersaglio, i ribozimi rivestono notevole interesse terapeutico come strumento per inattivare RNA nocivi quali quelli presenti in infezioni virali croniche o nei tumori prodotti da oncogeni mutati e in certe malattie genetiche. Una promettente applicazione dei ribozimi nella terapia anti-HIV (il virus responsabile dell'AIDS) è stata sviluppata recentemente dal laboratorio della Prof.ssa Irene Bozzoni del Centro Acidi Nucleici del CNR di Roma. Questi ricercatori hanno ottimizzato l'attività in vivo di ribozimi chimerici diretti contro il pre-mRNA della proteina Rev di HIV ottenendo: a) alti livelli di espressione intracellulare; b) corretta localizzazione nel nucleo; c) alta efficienza di inattivazione del trascritto bersaglio. L'aspetto più interessante di queste ricerche è l'uso di specifici RNA naturali o artificiali come "vettori" per indirizzare i ribozimi verso i vari compartimenti (nucleoplasma, nucleolo, citoplasma) con la possibilità di "attaccare" l'RNA in regioni differenti e in momenti diversi del metabolismo.

Anche l'esporto dell'RNA dal nucleo al citoplasma sembra offrire possibilità di interventi mirati. E’ noto, infatti, che l'esporto controllato di messaggeri fa parte delle strategie adottate da molti virus (emblematico il ruolo del sistema Rev-RRE in HIV) e che in certi tumori umani tale processo è alterato.

Il laboratorio da me diretto presso l'Istituto di Genetica Biochimica ed Evoluzionistica del CNR di Pavia, studia da tempo le proteine che rivestono i pre-mRNA a formare la fibra ribonucleoproteica (proteine hnRNP), tra le quali si ritiene vi siano i fattori che regolano il trasporto nucleo-citoplasmatico dell' RNA. Due di queste proteine, la hnRNPA1 e la hnRNPL, suscitano particolare interesse. Mentre la prima ha un ruolo generale nel trasporto, la seconda sembra "marcare" per l'esporto solo messaggeri privi di introni e dotati di una sequenza definita di riconoscimento (in modo analogo a quanto avviene nel sistema Rev-RRE di HIV), offrendo così la possibilità di applicazioni. Ad esempio l'inserimento della sequenza di riconoscimento di hnRNPL in vettori per l'espressione di cDNA (privi di introni) dovrebbe promuovere il trasporto dei corrispondenti trascritti nel citoplasma e la loro conseguente traduzione. Questa tecnica ha una potenziale utilità nella prospettiva di una vaccinazione anti-HIV in quanto potrebbe consentire una efficiente espressione intracellulare di proteine virali (quali Gag e Pol) indipendentemente dall'attività (fortemente citotossica) del sistema Rev-RRE.

Schema del protocollo di selezione-amplificazione in vitro detto SELEX

Una tecnica nuova, sviluppata di recente, ha ampliato enormemente i confini delle applicazioni dell'RNA. Essa consiste nella produzione automatizzata di pools di oligonucleotidi di RNA con sequenza casuale e nella selezione e successiva amplificazione delle molecole con determinate proprietà (catalitiche , di legame ecc.) Questo metodo , basato sui grandi numeri di sequenze (10¹⁵ - 10¹⁷), sulla versatilità strutturale e funzionale dell'RNA e sulla selezione, simula in vitro l'evoluzione genetica.

Il gruppo di ricerca coordinato dal Prof. Glauco Tocchini Valentini, direttore dell'Istituto di Biologia Cellulare del CNR di Roma, ha applicato il protocollo di selezione e amplificazione in vitro detto SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) per la selezione di RNA in grado di legare specificamente neurotrasmettitori e molecole analoghe di interesse farmacologico. In particolare, da una collezione di circa 10¹⁵ molecole diverse di RNA, contenenti una regione di 80 nucleotidi a sequenza casuale, sono stati selezionati RNA aptameri che legano selettivamente la L-dopamina. La caratterizzazione degli aptameri selezionati ha mostrato l'esistenza di una struttura di consenso responsabile del legame specifico alla dopamina, costituita da due domini stem-loop, contenenti cinque nucleotidi invariati. Con la stessa tecnica sono stati inoltre isolati nuovi tipi di mini-ribozimi derivati da varianti di RNA transfer (tRNA) naturali.

In questo caso una collezione di RNA randomizzati è stata inserita nell'introne di un precursore di tRNA ed è stata sottoposta ad una serie di cicli di selezione per ottenere molecole capaci di auto-excidersi. Sono stati quindi selezionati e caratterizzati vari RNA, con struttura secondaria a forcina, che possiedono una efficiente attivita' di taglio autocatalitico dipendente da Mg^2+.

Credo che questa breve, e necessariamente parziale, descrizione delle tecnologie dell'RNA basti a farne intravedere le potenzialità applicative che hanno già stimolato negli USA la nascita di numerose aziende specializzate

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